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TSA多重免疫熒光技術，也稱為多重免疫組化（mIHC），是一項能在給定組織切片上，以逐步增加能量的方式同時檢測多種目的蛋白的技術。
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——下面，就為大家?guī)?strong>TSA多色免疫熒光技術的詳細教程。

一、實驗原理

TSA技術利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記。在過氧化氫（H2O2）環(huán)境中，非活性的酪胺分子（T）被二抗偶聯(lián)的HRP催化激活，發(fā)生大量的酶促反應
成為具有短暫活性的中間態(tài)分子（T*）并形成共價鍵結合位點與鄰近蛋白（包括靶抗原蛋白、一抗、二抗及HRP）的富電子區(qū)域（如色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基）發(fā)生共價偶聯(lián)而沉積。
偶聯(lián)在酪胺分子上的熒光染料從而在共價偶聯(lián)蛋白周圍大量沉積，使信號被有效放大。

二、實驗步驟

【1】脫蠟復水?

1.1將切片放入烤箱中，60-65℃烤片，時間根據切片厚度和實驗室條件調整，一般在1-2小時之間。之后立即放入二甲苯或環(huán)保型脫蠟液中進行脫蠟，重復3次，每次10分鐘。

1.2將切片放入梯度乙醇中進行水化：100%乙醇5分鐘，重復2次；95%乙醇5分鐘；90%乙醇5分鐘（此步驟可根據需要選擇是否進行）；80%或75%乙醇5分鐘。之后用滅菌水洗片1分鐘，重復3次。

【2】抗原修復?

1.1將脫蠟水合后的玻片置于修復杯中，用抗原修復液（如檸檬酸、檸檬酸鈉或EDTA等）浸沒。

1.2將修復杯置于微波爐內高火煮沸，之后低火維持15-20分鐘。修復完成后，取出室溫自然冷卻至室溫，或用冰水快速降溫。

【3】封閉?

1.1去除玻片上殘存洗液，用組化筆或免疫組化筆在組織周圍畫圈。

1.2滴加適量封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫封閉30分鐘。

?【4】一抗孵育?

1.1去除玻片上的封閉劑，用移液器滴加稀釋的一抗溶液，浸沒樣本區(qū)域。

1.2室溫或37℃保濕振蕩孵育1-2小時（需針對不同抗體做優(yōu)化調整）。

1.3用1×TBST buffer浸洗玻片3分鐘，重復1-3次。
【5】二抗孵育?

1.1去除玻片上殘存的洗液，直接滴加與一抗相對應的二抗工作液（HRP標記），浸沒樣本區(qū)域。

1.2室溫保濕孵育10分鐘。

1.3用1×TBST buffer浸洗玻片3分鐘，重復1-3次。

【6】?TSA信號放大?

1.1去除玻片上殘存的洗液，滴加TSA工作液（用信號放大反應液按一定比例稀釋），浸沒樣本區(qū)域。

1.2室溫保濕振蕩孵育10-15分鐘。

1×TBST buffer浸洗玻片，室溫浸片3分鐘，重復3次。之后進行微波修復洗脫，室溫自然冷卻至室溫。再用滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2分鐘。

【7】重復染色?

如果需要進行多色標記，則重復步驟2至步驟6，但每次需更換不同靶蛋白的抗體和不同激發(fā)波長、發(fā)射波長的TSA染料。

?【8】細胞核染色?

去除玻片上殘存洗液，滴加DAPI工作液，室溫保濕孵育5-10分鐘。1×TBST buffer浸洗玻片，室溫浸片3分鐘，重復3次。之后用滅菌水洗片2分鐘。

【9】?封片?

1.1待玻片微干，用移液器在玻片上滴加抗淬滅封片劑，浸沒樣本區(qū)域。

1.2加蓋玻片，用指甲油封片。

【10】?封片??成像?

使用全光譜成像設備、標準熒光顯微鏡或多光譜組織成像系統(tǒng)對多重染色切片進行掃描成像。

三、注意事項

1.實驗前應設計好實驗方案，包括一抗與TSA熒光染料的搭配以及染色的順序。

2.盡量選擇特異性高的一抗，以確保染色結果的準確性。

3.低表達指標盡量與高亮度染料搭配，高表達指標與低亮度染料搭配，以優(yōu)化染色效果。

4.實驗過程注意避免切片干燥，以免影響染色結果。

通過以上步驟，你就可以掌握TSA多色免疫熒光技術的基本操作方法了。希望這篇教程能對你的實驗工作有所幫助！好還有關于TSA多色免疫熒光技術更多問題咨詢的歡迎留言哦
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