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在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，獲取高純度且結(jié)構(gòu)完整的RNA至關(guān)重要，它是開展RT-PCR、Northern雜交、mRNA分離、cDNA合成及體外翻譯等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)下，常見的RNA提取方法主要有2種。一種是基于異硫氰酸胍/苯酚混合試劑的液相提取法，也就是大家熟知的Trizol類試劑提取法（以下簡(jiǎn)稱Trizol法）。另一種則是基于硅膠膜特異性吸附原理的離心柱提取法。在這2種方法中，Trizol法表現(xiàn)尤為突出。它具備強(qiáng)大的細(xì)胞裂解能力，能夠高效地將細(xì)胞破碎，釋放出其中的RNA。同時(shí)，它還能對(duì)RNA起到良好的穩(wěn)定和保護(hù)作用，避免RNA在提取過(guò)程中被降解。正因如此，Trizol法在RNA提取領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用和高度認(rèn)可。下面普拉特澤生物就帶大家細(xì)了解一下如何使用Trizol法來(lái)提取RNA。

一、Trizol法提取RNA的基本原理

01細(xì)胞裂解
Trizol試劑中的異硫氰酸胍是一種強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，它能迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。同時(shí)，異硫氰酸胍還能有效抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性，保護(hù)RNA不被降解。

02.RNA分離
在細(xì)胞裂解后，加入氯仿進(jìn)行離心。氯仿的密度大于水，且能與苯酚結(jié)合，從而抽提酸性的苯酚。苯酚的存在促使RNA進(jìn)入水相，而大部分DNA和蛋白質(zhì)則保留在中間相或下層有機(jī)相中。通過(guò)離心，可以實(shí)現(xiàn)RNA與其他細(xì)胞成分的分離。

03.RNA沉淀
收集上層水相后，加入異丙醇以沉淀RNA。異丙醇的-OH基團(tuán)為親水基團(tuán)，能與水結(jié)合，從而使RNA脫水并產(chǎn)生沉淀。這一步是回收RNA的關(guān)鍵步驟。

04RNA洗滌與純化
使用乙醇洗滌RNA沉淀，以去除殘留的異丙醇和其他有機(jī)溶劑，同時(shí)去除RNA表面吸附的少量雜質(zhì)。洗滌后，RNA沉淀被干燥并用無(wú)RNase的水溶解，得到純凈的總RNA。

二、Trizol法中各個(gè)試劑的作用
01Trizol試劑Trizol試劑的主要成分是異硫氰酸胍、苯酚、8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等。

①異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一種強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，從而使核蛋白與核酸解聚，將RNA釋放到溶液中。同時(shí)，它還能有效抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性，保護(hù)RNA的完整性。
②苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖然可以變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此常與其他成分聯(lián)合使用以增強(qiáng)效果。
③8-羥基喹啉可以抑制RNase活性，與氯仿聯(lián)合使用時(shí)可顯著增強(qiáng)對(duì)內(nèi)源性和外源性RNase的抑制作用。
④β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵，從而進(jìn)一步抑制RNase活性。

02氯仿
氯仿是一種分子量較大的有機(jī)溶劑，其主要作用是加速有機(jī)相和水相的分層，形成兩相系統(tǒng)。RNA由于其親水性會(huì)留在上層水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則轉(zhuǎn)移到有機(jī)相或界面相。氯仿還可以抽提核酸溶液中少量的苯酚，減少苯酚對(duì)RNA的潛在損害。

04乙醇

乙醇的主要作用是去除沉淀中殘留的異丙醇和其他有機(jī)溶劑。此外，乙醇還有助于去除RNA表面吸附的少量雜質(zhì)，以提高RNA的純度。

05DEPC水DEPC水是指經(jīng)過(guò)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的水，DEPC能與RNA酶的活性基團(tuán)結(jié)合，使其變性失活。因此，DEPC水（無(wú)RNase水）在RNA提取過(guò)程中用于溶解RNA，防止RNA在溶解過(guò)程中被降解。

舉個(gè)例子：提取12孔板細(xì)胞RNA

1. 12孔板每孔加入700 μL的Trizol試劑（6孔板每孔加入1 mL，組織切取50 mg左右，加入1 mL的Trizol）后，于室溫裂解10 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

2. 用槍吹打細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至新的EP管中，每管加入140 μL的三氯甲烷（即加入Trizol體積1/5的三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min）。

3. 12000 rpm，4 ℃，離心20 min，樣品會(huì)分成3層：紅色的有機(jī)相、中間層和上層無(wú)色的水相，RNA主要在水相中。

4. 小心轉(zhuǎn)移上層水相（300 μL）至新的EP管中，這個(gè)過(guò)程操作要格外小心，不要吸取到有機(jī)相，可以使用黃槍頭套著小槍頭進(jìn)行吸取，分2次吸取。加入等量體積300 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min，使RNA沉淀。

5. 12000 rpm，4 ℃，離心15 min，棄上清。

6. 加入1 mL 75%乙醇，8000 rpm，4 ℃，離心5 min，重復(fù)2次洗滌能夠提高RNA的純度。

7. 離心結(jié)束后，使用吸引器將乙醇吸取干凈；無(wú)吸引器的話可以將上清倒掉后，再離心1～2 min，使用黃槍頭套白槍頭的方法將上清棄去。

8. 室溫放置晾干RNA沉淀，一般2～5 min即可，具體時(shí)間看RNA沉淀的大小，切勿干燥過(guò)度，會(huì)降低RNA的溶解度。

9. 加入適量DEPC水（無(wú)RNase水）用槍頭吸打幾次使RNA充分溶解。

[小編提醒] rpm在論文寫作時(shí)應(yīng)換算為“×g”的形式。

三、RNA質(zhì)量的檢測(cè)

分光光度法

使用nanodrop檢測(cè)RNA的濃度，除了檢測(cè)提取RNA的濃度，還應(yīng)該注意OD260/OD280和OD260/OD230這2個(gè)指標(biāo)。

①OD260/OD280 用于評(píng)估RNA中蛋白質(zhì)污染的比例。理論上，純RNA的OD260/OD280比值為2.0，可接受的范圍通常為1.8-2.2。當(dāng)比值低于1.8時(shí)，可能表明溶液中存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染；當(dāng)比值高于2.2時(shí)，可能表明RNA已經(jīng)水解為單核苷酸。

②OD260/OD230 用于評(píng)估RNA樣品中是否存在其他雜質(zhì)（如碳水化合物、多肽、苯酚等）。一般認(rèn)為，OD260/OD230比值在2-2.5表示RNA純度高；比值小于2，說(shuō)明存在鹽類、糖類或者有機(jī)物污染；比值大于2.5，說(shuō)明RNA已經(jīng)降解了。

瓊脂糖凝膠電泳

在標(biāo)準(zhǔn)的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜中，真核生物的RNA樣品通常會(huì)顯示出3條主要的條帶，從上到下依次為28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA。其中，28S和18S rRNA條帶最為明顯，且28S條帶的亮度通常約為18S條帶的兩倍，這表明RNA完整性較好。
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