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【完整版】小鼠灌流及取腦實(shí)驗(yàn) Protocol，新手也能輕松上手

普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)實(shí)方案的要求選擇不同的檢測(cè)方法，本文就跟大家一起繼續(xù)探究小鼠灌流及取腦實(shí)驗(yàn) Protocol，新手也能輕松上手~·
在對(duì)腦組織進(jìn)行切片和免疫染色或原位雜交等實(shí)驗(yàn)之前，為了排除血液對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，通常會(huì)對(duì)小鼠心臟灌流后再進(jìn)行解剖和切片。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1）灌流裝置：50mL 注射器 + 輸液管、灌流針頭（23G 或 25G 靜脈輸液針，剪去針尖斜面保留鈍頭，避免刺破血管）。（或有的實(shí)驗(yàn)室可直接用注射泵）

2）手術(shù)器械：眼科剪（直 / 彎各 1 把）、眼科鑷（直 / 彎各 1 把）、止血鉗（2 把）、大頭針、泡沫板、培養(yǎng)皿（6cm/10cm，用于盛放組織）。

3）其他：2個(gè)50ml離心管、PBS、4% 多聚甲醛（PFA）固定液<有毒注意安全>、塑料袋（裝小鼠尸體）、手術(shù)巾、一次性手套口罩。

實(shí)驗(yàn)步驟

麻醉固定

1）麻醉：腹腔注射4%水合氯醛（0.1ml/10g）：夾捏后肢無(wú)反應(yīng)、呼吸平穩(wěn)。（現(xiàn)在水合氯醛不符合動(dòng)物倫理，不鎮(zhèn)痛，按需換用其他麻醉方式：舒泰，各種牌子的肌松，戊巴比妥，三溴乙醇，異氟烷等）

2）固定：仰臥位固定于泡沫板上，用大頭針固定四肢（前肢呈 “外八字”，后肢伸直），腹部朝上，用手術(shù)巾擦拭腹部及胸部毛發(fā)。

（附：腹腔注射）

1）抓取小鼠：

放在飼養(yǎng)籠上，提其尾巴中部，水平偏下往后輕拉，小鼠爪子會(huì)自然會(huì)抓住籠子，此時(shí)應(yīng)該迅速抓住小鼠的頸背部的皮毛，最好是抓在小鼠的耳朵處，這樣可以更好固定小鼠的頭部，以防被咬。（但切記力氣不要過(guò)大，容易使小鼠窒息）。

再將小鼠的尾巴用左手無(wú)名指或小拇指固定，這樣就可以將小鼠整個(gè)軀干固定好，注意一定要讓小鼠處于一個(gè)舒服的體位，如果小鼠軀干不能保持豎直，很容易扎到臟器，引起出血，影響實(shí)驗(yàn)。

2）注射：

抓取小鼠后，應(yīng)腹部向上，頭呈低位（使臟器移至低位，避免扎傷）。右手持注射器，插入小鼠腹部，注射部位為小鼠后肢根部連線處任一側(cè)1.5cm處（建議從左側(cè)進(jìn)針，右側(cè)重要器官比較多避免扎入），緩慢以45度左右進(jìn)針，進(jìn)針深度小于1cm，進(jìn)針的感受為局部皮膚凹陷消失和落空感，可回抽看是否有血液/尿液。

3）拔針：

為了防止漏液，輕微旋轉(zhuǎn)針頭，再緩緩拔出。

在實(shí)驗(yàn)前，準(zhǔn)備酒精棉球，注射器在使用后要消毒才能給下一只小鼠使用，避免交叉感染。此外，注射前，也可以用酒精棉球擦拭小鼠皮膚，可以明顯辨別藥物是否注射到腹腔，如果看到鼓包，就是注射到皮下了。

暴露心臟與血管

1）剪開(kāi)皮膚：用眼科剪從劍突下沿腹中線向上剪開(kāi)皮膚（長(zhǎng)度約 2cm），再向兩側(cè)橫向剪開(kāi)，暴露胸肌。

打開(kāi)胸腔：用眼科剪沿肋骨兩側(cè)（避開(kāi)心臟）向上剪開(kāi)胸骨，打開(kāi)胸腔，此時(shí)可見(jiàn)心臟（左心室呈粉紅色，右心房呈暗紅色）。

灌流操作

1）進(jìn)針：左手持止血鉗固定心臟，右手將灌流針頭（提前連接輸液管，排空氣泡）從左心室心尖部（左心室最下端的尖狀結(jié)構(gòu)）斜向頭端刺入（角度約 30°，深度 3-5mm）刺入后用止血鉗將針頭與心肌一起夾住固定（避免針頭脫出）。

2）剪開(kāi)右心耳：用眼科鑷提起右心耳（右心房上方的暗紅色小囊狀結(jié)構(gòu)），用眼科剪剪一小口（約 1mm），作為灌流液流出通道（放血口）。

3）PBS 沖洗（去血）：推注注射器，先灌注 0.01M PBS（37℃或室溫，20g 小鼠用量 15-20mL，速度 5-10mL/min），先慢后快。觀察指標(biāo)：右心耳流出液從紅色逐漸變清，肝臟由紅變白，四肢輕微抽搐后停止，說(shuō)明血液沖洗充分（約 3-5 分鐘）。

4）PFA 固定：PBS 沖洗完成后，迅速切換至 4% PFA（4℃，用量與 PBS 相同，速度稍慢至 3-5mL/min）。觀察指標(biāo)：灌流時(shí)小鼠四肢逐漸僵硬，腹部鼓起，口鼻有少量固定液溢出，說(shuō)明固定液已擴(kuò)散至全身（約 5-8 分鐘）（尾巴翹起說(shuō)明灌流效果好）。

（步驟3）和4）也可用注射泵

5）終止灌流：PFA 灌流結(jié)束后，先拆開(kāi)注射器輸液管，再拔出針頭，避免液體回流。

取腦組織

1）斷頭存放：從緊貼著耳朵后面的地方斷頭，迅速把頭放進(jìn)生理鹽水的冰水混合物里，冷卻30s。

2）開(kāi)顱取腦：

從兩耳之間剪皮至兩眼之間，把鼠的頭皮整個(gè)往上扒，橫截面可見(jiàn)一個(gè)白點(diǎn)，是延髓；

從有延髓的孔把周?chē)墓穷^沿著上下左右的生長(zhǎng)方向拔掉，可見(jiàn)小腦；

小腦上方可見(jiàn)四大片頭蓋骨，逐個(gè)向上掀開(kāi)，可見(jiàn)完整大腦；

用彎鑷從大腦最前端伸入大腦下方，拔斷十二對(duì)腦神經(jīng)和小腦神經(jīng)連接，

即可取出。

3）標(biāo)本后固定、脫水：

將游離出的全腦放入 4%多聚甲醛 PBS 中，放于 4°C 后固定（不超過(guò) 24 小時(shí)）。

PBS 清洗后脫水（30%的蔗糖溶液沉底）處理。
文源自粥小八
如侵則刪

要資質(zhì)有資質(zhì)

要經(jīng)驗(yàn)有經(jīng)驗(yàn)

要案例有案例

好，小鼠灌流及取腦實(shí)驗(yàn) Protocol就介紹到這里啦~

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