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原位雜交操作步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，我們常見的原位雜交主要是RNA原位雜交與熒光原位雜交。普拉特澤生物病理實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為給大家詳細(xì)分享FISH原位雜交的實(shí)驗(yàn)操作步驟，一起來看看吧?。?/span>DNA原位雜交少見，如需要實(shí)驗(yàn)步驟可留言后期分享哦）

原位雜交

以癌組織為例，實(shí)驗(yàn)原理步驟如下：

原位雜交的實(shí)驗(yàn)原理我們有提到過：用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交, 從而對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析?；驹?/span>--堿基互補(bǔ)配對(duì)原理。

癌組織原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 將準(zhǔn)備做原位雜交的樣本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。

2. 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。

3. 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。

4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1 ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化3--30分鐘（視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整）。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

5. 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

6. 原位雜交的預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。

7. 雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。

8. 雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

9. 滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗。

10.滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

11.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

12.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

13.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

14.蘇木素復(fù)染，充分水洗。

15.酒精脫水，二甲苯透明，封片。

好了，關(guān)于FISH實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟我們就講完了，但是大家要注意的是，不同的組織樣本做原位雜交的實(shí)驗(yàn)方案與步驟均會(huì)有相應(yīng)的調(diào)整，準(zhǔn)備進(jìn)行實(shí)操的同學(xué)需要研究學(xué)習(xí)更多的實(shí)驗(yàn)案例來制定合適的方案以得到最好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)然啦，普拉特澤生物隨時(shí)在為您提供原位雜交代做服務(wù)哦。更多是原位雜交實(shí)驗(yàn)案例可直接聯(lián)系客服桃子姐姐：18570028002 領(lǐng)取觀看哦！

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