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圖1 Treg細(xì)胞流式檢測(cè)設(shè)門(mén)策略

Treg細(xì)胞簡(jiǎn)介

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cells,簡(jiǎn)稱(chēng)Tregs )是一類(lèi)控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群，早期亦稱(chēng)做suppressor T cells。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可分為天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（n T-regs）和誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(a T-regs或i T-regs)，如Th3、Tr1，另外尚有CD8 Treg、NKT細(xì)胞等，與自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切，其異常表達(dá)可導(dǎo)致自身免疫性疾病。其中Tr1細(xì)胞分泌IL-10；Th3細(xì)胞分泌TGF-β；

1995年Sakaguchi發(fā)現(xiàn)成年鼠中近10%的外周CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-2受體α鏈CD25。去除這群細(xì)胞會(huì)引起小鼠自發(fā)產(chǎn)生多種自身免疫性疾病而回輸該細(xì)胞則阻止疾病的發(fā)生。因此將這群細(xì)胞命名為CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與自身免疫性疾?。ㄈ鏘型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、再生障礙性貧血、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病、重癥肌無(wú)力）有關(guān)聯(lián)，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性甲狀腺炎，自身免疫性肝病、多種腎臟疾病等很多自身免疫性疾病的發(fā)病也有關(guān)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展都具有重要意義，對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于了解自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)疾病預(yù)后判斷、進(jìn)一步的治療有著深遠(yuǎn)的意義。

Treg細(xì)胞流式染色實(shí)例

Human (Blood): Treg cells

1.標(biāo)志物：CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ cells；

2.流式細(xì)胞儀：Beckman Coulter，CytoFLEX；

3.Panel設(shè)置如下

圖一

備注：由于CD25屬于連續(xù)性表達(dá)的抗體，盡量在允許的條件下設(shè)置FMO對(duì)照，FoxP3我們強(qiáng)烈建議使用FMO對(duì)照，因?yàn)楸磉_(dá)量不高，如果不設(shè)置FMO，可能會(huì)設(shè)門(mén)不正確的情況。

4.流式抗體及用量：FITC anti-humanCD4(5μL/test；357406；Biolegend)， APC anti-human CD25 (5μL/test； 302610； Biolegend)， PE anti-human Foxp3(5μL/test；320208； Biolegend)；

5.淋巴細(xì)胞分離：采用人淋巴細(xì)胞分離液（7111011，達(dá)科為生物）分離人外周血淋巴細(xì)胞。首先取3 mL淋巴細(xì)胞分離液，平衡到室溫，然后把用3mL PBS稀釋3mL外周血后加到淋巴細(xì)胞分離液上層（注意小心操作，切勿把血液加到淋巴細(xì)胞分離液下層），500g離心30 min取白膜層細(xì)胞，2mL PBS洗滌2~3次后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁷個(gè)/mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)全部采用100μL /tests/10⁶cells。

6.染色條件：首先Human TruStain FcX?(5μL/test;422302;Biolegend)，4℃，15 min；接著CD4和CD25表面染色，4℃， 30 min；然后破膜固定（True-Nuclear? Transcription Factor Buffer Set；424401；Biolegend；一般情況下采用True-Nuclear? Fix Diluent稀釋True-Nuclear? 4× Fix Concentrate為1×Fix solution)，室溫避光，60 min后采用ddH₂O稀釋10× PermBuffer成1×Perm Buffer進(jìn)行破膜，重復(fù)2~3次；

最后采用100μL1×Perm Buffer重懸細(xì)胞，Foxp3核內(nèi)染色，4℃，30 min。

7. 分析軟件：Flowjo (10.0.7)；

8. 圈門(mén)策略及染色: 見(jiàn)圖2

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圖2 不同供應(yīng)商的Foxp3和破膜劑染色效果比對(duì)