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DNA染色法檢測(cè)支原體步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，DNA染色法是常見的支原體檢測(cè)方法中最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的方法。普拉特澤生物表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)長(zhǎng)期為基礎(chǔ)科研人員提供支原體檢測(cè)外包服務(wù)，保證結(jié)果真實(shí)。

DNA染色法較為快捷，方法簡(jiǎn)單，但其靈敏度有一定的欠缺，易造成漏檢。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿，其激發(fā)波長(zhǎng)為350nm（紫外激發(fā)），發(fā)射波長(zhǎng)為420nm。該染料會(huì)結(jié)合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域，由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(shù)(55%~80%），所以可被染色而檢測(cè)到。支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體DNA, 證明該細(xì)胞有支原體污染。我們來一步步看：

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、CO2 培養(yǎng)箱、無菌小爬片。無菌培養(yǎng)皿、不含抗生素的完全培養(yǎng)液

2、二苯甲酰胺熒光染料濃縮液(50μg/ml) 。稱取5mg 二苯甲酰胺熒光染料加入100 ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液中，在室溫下用磁力攪拌30~40 min, 使完全溶解，-20℃ 避光保存。

3、二苯甲酰胺熒光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1 ml 上述濃縮液，加至100ml 無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 溶液中，終濃度為0.5μg/ml 。

4、固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液為細(xì)胞固定液。

5、封片液。0.1mol/L枸櫞酸22.2ml，0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混勻，調(diào)pH 至5.5 。

6、不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks平衡鹽溶液或PBS。經(jīng)多種方法檢測(cè)確定為支原體陰性的VERO 細(xì)胞。

二、DNA染色法檢測(cè)支原體操作步驟

1. 無菌收集待測(cè)細(xì)胞上清：懸浮細(xì)胞離心后取上清液。

2. VERO 細(xì)胞爬片：將小爬片無菌置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加VERO 細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度約3×104 個(gè)/ml) 2~3ml, 置于CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h 使其貼壁。

3. 制備標(biāo)本。向6 孔板內(nèi)滴加待檢細(xì)胞上清液約1ml, 注意設(shè)立對(duì)照組（已證實(shí)的支原體陽性和陰性細(xì)胞上清液），培養(yǎng)48h 后( VERO 細(xì)胞匯合前）將細(xì)胞爬片從平皿中取出。

4. 漂洗—將細(xì)胞爬片置于培養(yǎng)皿中，用不含酚紅、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS）漂洗3次。

5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。

6. 漂洗—待固定液自然風(fēng)干后用去離子水漂洗3 次。

7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。

8. 漂洗—去離子水中漂洗3 次，每次1 ~2 min 。

9. 封片，紫外激發(fā)，觀察。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷

當(dāng)陰性及陽性對(duì)照結(jié)果均成立時(shí)，結(jié)果有效。

1. 陰性結(jié)果僅見待檢細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。

2. 陽性結(jié)果熒光顯微鏡下細(xì)胞周圍或細(xì)胞膜表面可見大小不等、不規(guī)則的藍(lán)色熒光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)。

四、DNA染色法檢測(cè)支原體注意事項(xiàng)

1. 嚴(yán)格配制工作液及封片液。

2. 保證作為指示細(xì)胞的VERO 細(xì)胞沒有被支原體污染。

3. 必須同時(shí)設(shè)立陽性及陰性對(duì)照，注意重復(fù)，以排除假陽性和假陰性結(jié)果。
4. 應(yīng)全面觀察爬片，并注意可疑陽性的熒光點(diǎn)是凋亡小體還是支原體污染。

5. 可適當(dāng)調(diào)整熒光染料的工作濃度和染色時(shí)間，避免出現(xiàn)非特異性染色，如胞漿著色。

好啦，介紹完啦，是不是很簡(jiǎn)單？如果您有其他的問題或有支原體檢測(cè)外包的需求可以直接留言！普拉特澤生物技術(shù)會(huì)第一時(shí)間解答和回復(fù)的~

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