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到九月了哦~嬌小可愛(ài)的萌新師妹來(lái)了哦，有木有很開(kāi)心呀??！

那么問(wèn)題就來(lái)了：論如何在師妹面前裝一手好Bility呢？不想裝Bility的科研狗可不是正經(jīng)科研狗，裝不了Bility的科研狗更是沒(méi)能力的科研狗！

正所謂：愛(ài)也WB（順利一跑就跑出來(lái)了），恨也WB（不順利作死的也跑不出）。作為科研工作的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，曉其原理、知其操作、懂其分析，并能做出一塊“內(nèi)參條帶均勻平整，目的條帶錯(cuò)落有序”的好膜，必將助你在裝Bility路上獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷！

下面就簡(jiǎn)單介紹下WB實(shí)驗(yàn)技術(shù)：

1. Western blot是干啥的。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是①檢測(cè)蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定蛋白質(zhì)的存在與否（定性）；②確定同一蛋白質(zhì)在不同樣本中的多與少（半定量）。

2. 內(nèi)參蛋白是啥玩意。內(nèi)參就是內(nèi)部參照，對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定。比如常用的內(nèi)參β-actin即肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。依據(jù)不同的目的蛋白選擇合適的內(nèi)參。

3. BCA法是個(gè)啥。堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)將二價(jià)銅離子還原成一價(jià)銅離子，BCA與一價(jià)銅離子結(jié)合形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，在562nm處有最大吸光值且與蛋白濃度成正比。（個(gè)人覺(jué)得可以順帶給師妹講一下ELISA酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)）

4. 電泳之PAGE的濃縮效應(yīng)與分子篩作用。①電泳開(kāi)始階段，由于不連續(xù)pH梯度而將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶，提高分離效果；②PAGE具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能起分子篩作用。

5. 蛋白變性之SDS。影響電泳的3因素：蛋白質(zhì)的大小、形狀及所帶電荷。①SDS結(jié)合蛋白質(zhì)后再加熱，能把折疊的蛋白質(zhì)打開(kāi)，排除形狀的影響；②SDS帶強(qiáng)負(fù)電荷，結(jié)合蛋白質(zhì)后使其原有電荷微不足道，排除所帶電荷的影響。SO，電泳結(jié)果只跟蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。

6. 十萬(wàn)個(gè)為什么之封水。封水目的是是分離膠表面平直并排除氣泡，so，均勻且勻速，可以輕微晃蕩（輕微啊！晃不好別怪我?。?。膠水之間形成清晰界面是凝膠聚好的標(biāo)志。

7. 十萬(wàn)個(gè)為什么之上樣量一致。這個(gè)就不用多講了吧。上樣量不一致蛋白質(zhì)含量不一致，最后的條帶結(jié)果有什么意義呢？

8. 轉(zhuǎn)膜的故事。這個(gè)也比較簡(jiǎn)單，手輕點(diǎn)不要弄破了、不要有氣泡、膜的大小適合（PVDF膜還是有點(diǎn)小貴的，年輕人不要浪費(fèi)?。?。最好做個(gè)標(biāo)記（我會(huì)在一個(gè)角剪一丟丟），標(biāo)記正反面哦！

9. 封閉與抗體孵育的故事。一抗特異性結(jié)合蛋白質(zhì)，標(biāo)記有HRP（跟顯色底物反應(yīng)）的二抗特異性的結(jié)合一抗，易于檢測(cè)。封閉就是為了防止抗體與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生高背景。我一般一抗用一次，二抗回收（最多用三次）。脫脂牛奶容易發(fā)臭的！用不完及時(shí)丟！

一點(diǎn)小建議：

①請(qǐng)做一塊好膠！膠的影響挺大的。玻璃板洗干凈一點(diǎn)！

②預(yù)實(shí)驗(yàn)一定要做！怎么也得有三個(gè)抗體梯度吧。不然一頓操作猛如虎，條帶結(jié)果一團(tuán)糊。

③請(qǐng)做好個(gè)人防護(hù)，制膠材料有很多神經(jīng)毒素的！