考馬斯亮藍測蛋白濃度步驟
2024-12-26 14:12:43
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
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可承接染色實驗外包服務(wù)。
1.準備試劑與器材
?考馬斯亮藍G-250試劑?：通常是將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL的95%乙醇中，再加入適量的85%磷酸，最后用蒸餾水稀釋至1L。具體配比可能因?qū)嶒炐枨蠖杂胁煌?/span>
?標準蛋白質(zhì)溶液?：常用牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白，配制成一定濃度的溶液，如1mg/mL或100μg/mL，用于制作標準曲線。
?分光光度計?：用于測定染色后溶液在595nm處的吸光度值。
?試管、移液器、渦旋混勻器等?：用于溶液的配制、混合和測定。
2.制作標準曲線
①配制不同濃度的標準蛋白溶液?：取一系列潔凈的試管，分別加入不同體積的標準蛋白溶液和蒸餾水，使各試管中蛋白濃度呈梯度分布。
?②加入考馬斯亮藍G-250試劑?：向各試管中加入等體積的考馬斯亮藍G-250試劑，并充分混勻。
?③測定吸光度值?：使用分光光度計，在595nm波長下測定各試管中溶液的吸光度值。
④繪制標準曲線?：以標準蛋白溶液濃度為橫坐標，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。通常，標準曲線應(yīng)呈線性關(guān)系，以便后續(xù)計算待測蛋白濃度。
3.測定待測蛋白濃度
?①稀釋待測蛋白溶液?：根據(jù)待測蛋白的預(yù)估濃度，將其稀釋至適當(dāng)范圍，使測定值落在標準曲線的線性范圍內(nèi)。
②加入考馬斯亮藍G-250試劑?：向稀釋后的待測蛋白溶液中加入等體積的考馬斯亮藍G-250試劑，并充分混勻。
?③測定吸光度值?：同樣使用分光光度計，在595nm波長下測定待測蛋白溶液的吸光度值。
?④計算待測蛋白濃度?：根據(jù)測得的吸光度值，對照標準曲線，即可計算出待測蛋白的濃度。
4.注意事項
?⑴試劑配制?：考馬斯亮藍G-250試劑的配制需準確，避免濃度過高或過低影響測定結(jié)果。
?⑵溶液混合?：在加入考馬斯亮藍G-250試劑后，應(yīng)充分混勻溶液，確保染料與蛋白充分結(jié)合。
?⑶測定時間?：在加入試劑后，應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)完成測定，避免顏色變化導(dǎo)致測定結(jié)果不準確。
⑷儀器校準?：使用分光光度計前，應(yīng)進行儀器校準，確保測定結(jié)果的準確性。
通過以上步驟，即可利用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。該方法具有操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗中常用的蛋白質(zhì)定量方法之一。
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