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熒光定量PCR實驗常見問題及其解決方法由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，普拉特澤生物表達檢測平臺專業(yè)承接熒光定量PCR實驗代做服務(wù)，在實時熒光定量PCR的實驗操作中積累了大量的經(jīng)驗，同時也遇到了不計其數(shù)的問題，表達檢測實驗的技術(shù)在一次又一次實踐中總結(jié)了遇到各種常見問題的原因和解決方法。本文就跟大家一起來看實驗過程中出現(xiàn)頻率最高的一些問題：

1、RNA得率低

原因1：樣品裂解不完全

解決：適當選擇起始材料的量，加入合適體積的裂解液。

原因2：勻漿不充分

解決：減少材料的數(shù)量; 根據(jù)材料類型選擇合適勻漿方法; 組織樣本適宜切成小塊后，在Trizol試劑中均質(zhì)，充分裂解。

原因3：用于分光光度分析的稀釋液PH值太低

解決：使用TE（PH 8.0）作為稀釋液進行讀數(shù)測定。

2、RNA降解

問題1：RNA酶污染

解決：戴上手套操作，勤換手套; 耗材與試劑均應(yīng)作RNase-free處理; 操作中減少EP管的開蓋次數(shù)與時間。

問題2：樣品處理不當

解決：新鮮組織收獲后，立即凍結(jié)在-70℃或液氮中; 也可以在Trizol試劑中均質(zhì)后，-70℃下儲存。

3、Abs260/Abs280比值低

問題1：酸性pH降低吸光度比率

解決：使用TE緩沖液(pH 8.0)作為稀釋液進行測定。

問題2：水相被酚相污染

解決：小心轉(zhuǎn)移上層水相，避免吸入中間相，可留少許上層相不吸取。

4、DNA 污染

問題1：Trizol加少了，造成DNA /核蛋白復(fù)合物與RNA水相分離不完全

解決：適當選擇起始材料的量，加入合適體積的裂解液。

問題2：水相被苯酚相污染

解決：小心轉(zhuǎn)移上層水相，避免吸入中間相，可留少許上層相不吸取。

5、下游反應(yīng)中RNA表現(xiàn)不佳

問題1：乙醇或鹽類污染

解決：溶解RNA之前，注意洗滌沉淀，并通過空離和風(fēng)干除去殘留。

6、熔解曲線有雜峰

問題1：引物二聚體

解決：

（1）提高退火溫度

（2）降低引物濃度，甚至調(diào)整正向引物和反向引物的比例。一般引物最終濃度設(shè)定為200 nM，但如有必要，可降低至60 nM。

（3）鎂離子的濃度最好在3 mM左右。高于這個濃度，引物二聚體更易形成;

（4）重新設(shè)計引物并評估它們的二聚化傾向。

問題2：非特異性擴增

解決：重新設(shè)計引物并通過預(yù)實驗評估特異性。

問題3：cDNA模板降解

解決：模板避免反復(fù)凍融，可適當分裝保存，每次取用一小管。

7、無擴增信號

原因：低表達，反轉(zhuǎn)錄，或定量儀器問題

好啦！那實時熒光定量PCR實驗常見問題及其解決方法咱們就分享到這里啦！希望能幫到大家哦，如果您遇到了更多解決不了的問題或需要外包實時熒光定量PCR實驗，歡迎隨時留言哦~咱們下期見！

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