相關(guān)實驗
實驗承諾函
咨詢記錄
技術(shù)文章
城市
時間
福建省福州市
2026-01-10 18:06:34
浙江省湖州市
2026-01-10 17:46:52
浙江省寧波市余姚市
2026-01-10 14:39:30
江蘇省南通市
2026-01-10 11:24:24
江蘇省南通市
2026-01-10 10:35:25
江蘇省南通市
2026-01-10 07:41:16
國外
2026-01-09 16:53:27
江蘇省無錫市
2026-01-09 13:11:12
江蘇省蘇州市
2026-01-09 06:00:54
浙江省麗水市
2026-01-08 17:09:08
基因表達調(diào)控基本特點
2024-07-19 14:50:50
ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗實驗標準曲線
2024-03-28 16:06:29
ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果分析
2024-03-28 13:44:05
ELISA原理、操作以及注意事項
2024-03-26 17:21:23
QPCR目的和意義
2024-01-15 17:36:24
核質(zhì)分離實驗QPCR數(shù)據(jù)處理
2024-01-15 15:05:16
QPCR數(shù)據(jù)分析以及作圖方法
2024-01-11 14:23:33
QPCR實驗設(shè)計【QPCR實驗外包】
2024-01-10 17:03:29
QPCR原理和主要的三個步驟
2024-01-09 17:37:18
QPCR原理以及數(shù)據(jù)處理
2024-01-05 14:09:57
QPCR檢測實驗詳細的步驟與報告（三）
2024-01-05 13:07:01
QPCR檢測實驗詳細的步驟與報告（二）
2024-01-04 17:05:09
QPCR檢測實驗詳細的步驟與報告(一）
2024-01-04 13:48:46
QPCR檢測的是什么？
2024-01-03 17:34:53
WB檢測實驗報告和詳細的操作步驟（下）
2023-12-21 14:42:54
WB檢測實驗報告和詳細的操作步驟（中）
2023-12-21 13:36:16
WB檢測實驗報告和詳細的操作步驟(上)
2023-12-20 16:36:30
什么是western blot？
2023-12-20 14:22:03
PCR設(shè)計引物的具體步驟【科研干貨】
2023-11-17 13:59:50
引物設(shè)計的依據(jù)【小白適用】
2023-11-16 14:40:06
qPCR引物設(shè)計流程【一文搞懂】
2023-11-16 13:11:45
如何巧妙設(shè)計引物？
2023-11-14 17:29:47
關(guān)于SNP檢測流程和應用
2023-03-29 11:24:18
做酶聯(lián)免疫吸附劑測定實驗需要注意什么？
2023-03-27 16:28:08
實時熒光定量 PCR（qPCR）的介紹
2023-03-20 13:08:33
WB實驗檢測介紹——檢測小鼠組織中GSTM2的表達
2023-03-17 14:12:46
WB實驗原理及流程圖
2023-03-16 16:25:48
亞硫酸氫鈉測序（BSP）實驗步驟【BSP外包】
2022-11-22 15:00:00
什么是亞硫酸氫鈉測序？【甲基化檢測外包】
2022-11-18 15:47:24
DNA染色法檢測支原體操作步驟【支原體檢測外包】
2022-11-04 10:39:27
培養(yǎng)法檢測支原體操作步驟【支原體檢測外包】
2022-11-04 10:22:06
PCR檢測支原體操作步驟【支原體檢測外包】
2022-11-03 17:25:02
支原體檢測方法大全【支原體檢測外包】
2022-11-02 17:03:33
什么是支原體檢測？【支原體檢測外包】
2022-10-27 17:48:46
SNP檢測常見問題答疑下篇
2022-08-09 19:14:35
SNP檢測常見問題答疑上篇
2022-08-09 11:24:24
直接測序法檢測SNP詳解——最常用的方法
2022-08-05 08:58:37
Taqman探針法檢測SNP分型詳解
2022-08-04 15:12:43
SNP檢測方法總結(jié)，有你用過的嗎？
2022-08-02 17:56:41
SNP/單核苷酸多態(tài)性檢測最常用的三種方法
2022-08-02 15:23:47
什么是SNP/單核苷酸多態(tài)性？
2022-08-02 14:16:49
?實時熒光定量PCR實驗技術(shù)答疑
2022-07-28 13:55:45
實時熒光定量PCR常見問題及解決方法
2022-07-27 17:12:19
熒光定量PCR實操注意事項，注意避雷！
2022-07-27 11:49:18
熒光定量PCR結(jié)果分析解讀—熒光定量PCR外包
2022-07-26 11:17:27
熒光定量PCR實驗操作步驟，你做對了嗎？
2022-07-25 17:11:08
什么是實時熒光定量PCR？
2022-07-22 10:18:49
六種甲基化檢測方法【附視頻教程】
2022-05-16 17:09:40
DNA甲基化實驗操作步驟
2022-05-13 11:52:54
?DNA甲基化實驗介紹【科研小白】
2022-05-13 10:27:04
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實操作常見問題處理方法【干貨滿滿】
2022-04-08 16:34:54
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗操作常見問題答疑【附視頻教程】
2022-04-07 17:30:33
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗操作注意事項【附視頻教程】
2022-04-07 16:07:13
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗詳細操作步驟【附視頻教程】
2022-04-07 13:27:43
科研小白看的ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗簡介與原理【附視頻教程】
2022-04-06 16:01:15
高分文章都怎么研究m6A甲基化
2022-01-10 14:50:24
DNA甲基化提高癌細胞對EGFR抑制劑敏感性的原因
2021-10-27 00:29:41
高分文章研究RNA甲基化詳細步驟
2021-10-26 17:19:51
m6A甲基化研究思路設(shè)計方法
2021-10-26 15:44:54
Nature子刊 | DNA甲基化 甲基轉(zhuǎn)移酶異位靶向擬南芥中CG
2021-05-27 17:59:59
實時熒光定量PCR檢測步驟和注意事項【附視頻教程】
2021-04-26 21:06:57
甲基化檢測的幾種方法和實驗流程【附視頻教程】
2021-04-23 11:19:00
細胞因子檢測方法怎么選？常用檢測方法優(yōu)缺點整理
2021-04-12 15:25:26
這是我見過的WB結(jié)果圖最多的文章！【文獻解讀】
2020-12-17 15:53:24
如何搞定Western Blot中的“奇葩”條帶【干貨文章】
2020-12-11 15:32:22
免疫沉淀及Pulldown這些方法原理你了解多少【新手入門】
2020-12-11 15:01:28
WB實驗技術(shù)介紹【新手入門】
2020-12-11 14:59:38
實驗介紹
【應用簡介】
實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過相對定量或絕對定量的方法確定各個樣本的本底表達量。qPCR檢測常用的兩種方法：染料法和TaqMan探針法。
【技術(shù)原理】
TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團，3’端偶聯(lián)淬滅基團，游離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發(fā)光基團發(fā)出的熒光會被淬滅基團吸收淬滅，探針被水解，發(fā)光基團和淬滅基團遠離就可以檢測到熒光信號。反應開始時，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針，發(fā)光基團會跟淬滅基團分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。
TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個反應體系中加入多條探針，可以做多個基因同時檢測。
【實驗流程】
案例展示
結(jié)果分析：NTC組正常，表明QPCR實驗結(jié)果可信，組間差異較小，操作合格。
常見問題
一、引物設(shè)計
1、序列選取應在基因的保守區(qū)段；
2、Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp-150bp；
3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；
4、典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；
5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C；
6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基；
7、為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；
8、探針位置盡可能地靠近上游引物；
9、探針的5'端應避免使用堿基G，引物的3’端避免使用堿基A。探針長度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%；
10、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；
11、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在Blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。
二、熱啟動
熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。
三、鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個方面，如：對DNA聚合酶的活性的影響進而影響產(chǎn)量;對引物退火的影響，進而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。
四、模板質(zhì)量
模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會抑制PCR。
五、防止殘余污染
1、PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源(非殘余污染)。
2、可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準備新反應前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫φ諜z測污染。使用預先混合的反應成份，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標，樣本盡量新鮮，細胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進行預實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號
湘公網(wǎng)安備