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實時熒光定量PCR技術(shù)答疑由普拉特澤生物技術(shù)總結(jié)分享。實時熒光定量PCR是普拉特澤生物——表達檢測平臺的常規(guī)實驗，本文主要根據(jù)普拉特澤生物承接的所有的熒光定量PCR實驗特殊問題與進行實驗技術(shù)咨詢的同學(xué)常常提出的問題總結(jié)，分享給大家：

1、實時熒光定量技術(shù)是什么？有什么用？

實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time qPCR），其基本原理是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光染料探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程。熒光定量PCR最大的優(yōu)勢可以對初始模板進行定量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。
2、CT值是什么？實驗結(jié)果沒有CT值怎么回事？

在相對定量中，Ct值一般控制在15~25之間比較好，如果在絕對定量中，對低拷貝數(shù)的樣品，Ct值會增大，但是一般不宜超過40循環(huán)，否則定量不準確。因此，判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況，需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。可能原因主要是：

（1）擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適，需要進行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計不合理，需要重新設(shè)計；

（2）PCR程序不合適，改用三步法進行反應(yīng)，或者優(yōu)化退火/延伸溫度，可以適當降低退火溫度；退火/延伸時間短（可以在推薦的時間條件下延長10s）；

（3）MgCl2濃度不合適，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；

（4）PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp；

（5）模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

3、我的熒光定量PCR結(jié)果標準曲線線性關(guān)系不佳怎么回事？

如果遇到標準曲線線性關(guān)系不佳）的情況，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

（1）標準品稀釋或者加樣存在誤差，吸樣不準，使得標準品不呈梯度；

（2）標準品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標準品反復(fù)凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，不要反復(fù)凍融，現(xiàn)配現(xiàn)用；

（3）引物或探針不佳。重新設(shè)計更好更穩(wěn)定的引物或探針；

（4）模板中存在抑制物。模板濃度過高，根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量不超過500ng，以50~500ng為宜。

4、為什么我的陰性對照擴增有信號？

如果陰性對照擴增有信號，首先排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當，造成交叉污染：

（1）引物設(shè)計不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

（2）引物濃度不佳。適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

（3）鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。

（4）模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增。

（5）交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染，建議對操作環(huán)境進行處理，或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。

5、為什么我的擴增曲線是S形的？

如果遇到擴增曲線異常，很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

（1）模板的濃度太高或者降解；

（2）熒光染料的降解；

（3）在操作熒光定量PCR時，帶上新的一次性手套，蓋上避免任何指紋或者字跡等；

（4）液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā)，沒有很好的聚集在管子里；

（5）氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。

好啦，表達檢測平臺常常收到的技術(shù)咨詢就是這么多啦，如果您關(guān)于熒光定量PCR還有其他的問題或者實驗需要外包歡迎給客服留言，咱們一起學(xué)習(xí)共勉~

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