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七夕快樂！沒有對象的同學(xué)來跟普拉特澤生物一起繼續(xù)學(xué)習(xí)哦~今天咱們來繼續(xù)學(xué)習(xí)的是SNP檢測。上期我們講完了Taqman探針法檢測SNP分型，不記得的可以回去復(fù)習(xí)哦。今天來學(xué)的是用直接測序法檢測SNP的詳細(xì)操作步驟，一起來看看吧：

一、樣本基因組DNA的提取

1. 取50 mL血樣于離心管中，加PBS緩沖液至1.5 mL，輕輕地?fù)u勻。冷凍離心機(jī)6500 rpm離心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。重復(fù)洗2次。

2. 向保留沉淀物的離心管中加入DNA提取液500 mL，15 mL的蛋白酶K，混勻放入55℃水浴鍋中消化過夜。

3. 將消化過夜的反應(yīng)液冷卻至室溫，加入等體積冰冷的飽和酚溶液，蓋緊離心管蓋，緩慢地來回顛倒10 min（在冰上進(jìn)行），形成均勻的乳濁液。

4. 冷凍離心機(jī)12000 rpm離心10 min。

5. 小心地吸取上層水相至新管，用等體積飽和酚再抽提一次。

6. 用等體積的氯仿再抽提一次。

7. 離心后再取上清液于另一離心管中，加入1∕10體積3mol/L的NaAc使終濃度達(dá)到0.3mol/L，并加2倍體積冷的無水乙醇，上下倒置混勻，置-20℃冰箱沉淀30-60 min。

8. 冷凍離心機(jī)12000 rpm離心10 min，棄上清液。

9. 加入500 μl 70%冷乙醇小心洗滌沉淀。冷凍離心機(jī)6500 rpm離心5 min，棄上清，用干凈的吸水紙或用吸頭將管壁殘留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否則難以溶解。

10. 沉淀于100 μl超純水中。

11. 將提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及濃度的測定。

二、SNP分型檢測

1. 引物的設(shè)計與合成

(1) 查閱文獻(xiàn)，參考文獻(xiàn)中的引物，直接合成；

(2) 根據(jù)SNP的位置找到其序列，設(shè)計引物并合成；

2. PCR擴(kuò)增片段

(1) PCR擴(kuò)增體系；

(2) PCR擴(kuò)增程序；

(3) 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(4) A. 測序法：對目的條帶進(jìn)行切膠回收純化測序，根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計分析各個樣本下該SNP的基因型；

B. 酶切法：一般這種方法都有文獻(xiàn)支持，在前期可以確定好對應(yīng)的內(nèi)切酶。根據(jù)內(nèi)切酶的反應(yīng)體系將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)酶切條帶來統(tǒng)計分析各個樣本下該SNP的基因型。

三、SNP檢測

1. 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)基因的序列設(shè)計擴(kuò)增片段引物并合成。

2. PCR擴(kuò)增片段

(1) PCR擴(kuò)增體系：

(2) PCR擴(kuò)增程序：

(3) 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(4) 將目的條帶進(jìn)行切膠回收純化測序，將測序結(jié)果與NCBI庫進(jìn)行比對，找出各個樣本目的基因突變的位置和形式，對結(jié)果進(jìn)行匯總分析，計算某一種突變所占的百分比，根據(jù)結(jié)果找出關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)的幾個突變位點(diǎn)，即為標(biāo)簽突變位點(diǎn)。將這些突變位點(diǎn)與NCBI中SNP庫進(jìn)行比對分析，找出新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，可用于后續(xù)的驗(yàn)證和研究。

好啦！那直接測序法檢測SNP分型的具體實(shí)驗(yàn)步驟就介紹到這里啦，如果您有什么實(shí)驗(yàn)相關(guān)的技術(shù)問題或者SNP檢測實(shí)驗(yàn)外包的問題歡迎留言~

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