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流式檢測(cè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)結(jié)果圖解讀

細(xì)胞周期，是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞間期又分為C0期、G1期、S期、G2期；細(xì)胞分裂期即M期。

G0/G1期：G1期，細(xì)胞體積逐漸增大，細(xì)胞開(kāi)始RNA和蛋白質(zhì)的合成，DNA含量保持二倍體狀態(tài)，G0期是脫離細(xì)胞周期暫時(shí)停止分裂的一個(gè)階段。但在一定適宜刺激下，又可進(jìn)入周期，從DNA含量上無(wú)法區(qū)分G0與G1期；

S期：在這一階段完成DNA的合成以及合成與DNA組裝構(gòu)成染色質(zhì)等有關(guān)的組蛋白。DNA含量在此時(shí)期增加，介于G1期和G2期之間；

G2/M期：G2期是DNA復(fù)制結(jié)束和開(kāi)始有絲分裂之間的間隙。從DNA含量上同樣無(wú)法區(qū)分G2期和M期。

PI/RNase染色法技術(shù)原理

檢測(cè)細(xì)胞周期最常用的方法就是檢測(cè)細(xì)胞DNA含量，正常生長(zhǎng)的細(xì)胞都會(huì)經(jīng)歷分裂過(guò)程，G0/G1期是兩倍體時(shí)期，S期DNA開(kāi)始合成，到G2/M期，細(xì)胞處于四倍體時(shí)期，之后細(xì)胞一分為二，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期。

碘化丙啶(Propidium ，簡(jiǎn)稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。

實(shí)驗(yàn)方法（以懸浮細(xì)胞為例）

1、離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌2次；

2、細(xì)胞固定：用殘留的少許PBS混勻沉淀，緩慢加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊搖勻，避免細(xì)胞粘連在一起，置于-20℃冰箱固定4h以上；

3、細(xì)胞染色：350g離心5 min，棄上清，用2mL的PBS洗滌2次，按照10^6 cells 加入500μLPBS，含50μg/mL的PI，100μg/mL的RNaseA，4°C避光孵育15 min-30 min（可將PI直接用PBS配成工作濃度，RNaseA現(xiàn)加進(jìn)去）；

4、上機(jī)分析：由于PI具有很強(qiáng)的粘附性，容易使細(xì)胞聚團(tuán)，建議過(guò)濾后再上機(jī)分析，同時(shí)別忘了檢查流式儀器的狀態(tài)，一般低速收集2-3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞即可。

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流式細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果圖解讀：

1、縱坐標(biāo)Cell Number：即計(jì)數(shù)的有效細(xì)胞數(shù)；

2、橫坐標(biāo)DNA Content：即DNA含量；

3、常用的流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的方法是依據(jù)細(xì)胞DNA含量（橫坐標(biāo)）來(lái)分析的；

4、G0/G1期：DNA復(fù)制還沒(méi)開(kāi)始，也是DNA含量最少的，即流式檢測(cè)結(jié)果圖的第一個(gè)峰；

5、S期：DNA開(kāi)始復(fù)制，到完成復(fù)制，是一個(gè)一倍DNA到二倍DNA的過(guò)程，在流式結(jié)果圖中顯示期跨度特別大（第二個(gè)不高但很寬的峰）；

6、G2期：DNA復(fù)制完成至分裂的一段時(shí)間，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)含二倍DNA，在流式結(jié)果圖中的第三個(gè)峰；

7、M期：細(xì)胞分裂過(guò)程，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)也是二倍DNA，用DNA含量的方法是無(wú)法與G2期分開(kāi)。

8、右側(cè)數(shù)字含義：Dip G1-58.65% at 50.38%，即G1期DNA含量平均值為58.65%；G1期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的50.38%，以此類推。

技術(shù)總結(jié)

1、PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase消化RNA；

2、進(jìn)樣速度：進(jìn)樣速度為低速。若峰形較寬，可能就是進(jìn)樣速度太快；

3、儀器質(zhì)控定期做，盡可能排除因機(jī)器設(shè)置引起的峰形加寬；

4、排除粘連細(xì)胞（FL2-A/FL2-W），最大程度的減少粘連細(xì)胞帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果。

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