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實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟和注意事項(xiàng)【附視頻教程】

一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的概念

什么是QPCR？實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物異形結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最終通過(guò)相對(duì)定量和絕對(duì)定量的方法確定各個(gè)樣本的表達(dá)量。

二、QPCR實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用及分類

關(guān)于QPCR絕對(duì)定量和相對(duì)定量的應(yīng)用，絕對(duì)定量技術(shù)通常在病原體檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)以及基因表達(dá)研究中應(yīng)用比較廣泛；相對(duì)定量應(yīng)用于mRNA表達(dá)量分析、siRNA干擾效果的驗(yàn)證和基因過(guò)表達(dá)以及基因芯片效果的驗(yàn)證。

三、QPCR技術(shù)的兩大分類優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)步驟：

1、樣本制備；

2、RNA提取；

3、反轉(zhuǎn)錄；

4、QPCR引物設(shè)計(jì)及預(yù)實(shí)驗(yàn)；

5、實(shí)時(shí)熒光定量QPCR數(shù)據(jù)分析。

定量.png

五、QPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)有哪些注意事項(xiàng)

1、擴(kuò)增曲線和熔解曲線

對(duì)于QPCR實(shí)驗(yàn)中涉及到的擴(kuò)增曲線和熔解曲線需要做如下的要求，由于擴(kuò)增曲線是反映PCR循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的一條曲線，所以這條曲線要平滑完整，而熔解曲線是將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)得到是對(duì)數(shù)圖譜，所以要求熔解曲線是單一峰；

2、Ct值

同樣是QPCR實(shí)驗(yàn)中需要注意的重要參數(shù)，它是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，也就是說(shuō)，我們達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期的時(shí)候，Ct值的起始value與平臺(tái)期之間存在一個(gè)Ct循環(huán)數(shù)的差異，我們稱之為該基因的擴(kuò)增倍數(shù)。經(jīng)過(guò)了多少個(gè)循環(huán)數(shù)達(dá)到平臺(tái)期所求出來(lái)的差值就是我們的Ct值。其特點(diǎn)是DNA模板量越多，達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)越少，所以Ct值越小。

如圖所示，它的Ct value越偏向于右邊，它的起始模板量越少，越偏向于左邊，起始模板量越高。而它們最終都是要達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期的。

3、反應(yīng)體系配置

配置體系時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)：

①SYBR MasterMix不要反復(fù)凍融；

②在一個(gè)管中配置Mix，減少加樣誤差；

③所有成分加完后，離心去除氣泡；

④每個(gè)樣品至少3-4個(gè)平行孔，方便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；

⑤需設(shè)置NTC陰性對(duì)照組，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)材料是否具有污染。

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