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甲基化檢測(cè)的幾種方法和實(shí)驗(yàn)流程【附視頻教程】

一、甲基化是什么

甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過(guò)程?？尚纬筛鞣N甲基化合物，或是對(duì)某些蛋白質(zhì)或核酸等進(jìn)行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。在生物系統(tǒng)內(nèi)，甲基化是經(jīng)酶催化的，這種甲基化涉及重金屬修飾、基因表達(dá)的調(diào)控、蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)以及核糖核酸(RNA) 加工。

甲基化分為兩類：

1、蛋白質(zhì)甲基化：一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化；

2、DNA甲基化：指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。（包括RNA甲基化，我們這里主要講DNA甲基化）

二、甲基化檢測(cè)的幾種常見(jiàn)方法

1、HRM（高分辨率熔解曲線分析）

2、MSP（甲基化特異性的PCR），可以對(duì)某個(gè)特定的基因做定性分析

3、酶切法，針對(duì)總DNA的一種定性方法，不能針對(duì)某個(gè)具體的基因

4、BSP（亞硫酸氫鹽測(cè)序法），可以明確到某個(gè)特定的基因、特定的區(qū)域、特定的CG位點(diǎn)。這也是比較推薦的金標(biāo)準(zhǔn)。

我們今天主要講后三種方法。

三、甲基化檢測(cè)的幾種方法的實(shí)驗(yàn)原理

1、基于亞硫酸氫鹽修飾的甲基化檢測(cè)原理（BSP和MSP）

甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。

亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測(cè)序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。

2、酶切法實(shí)驗(yàn)原理

使用兩個(gè)對(duì)甲基化敏感性不同的限制酶來(lái)分析特定位點(diǎn)的DNA甲基化狀態(tài)。EpiMspl和EpiHpall是具有CCGG特異性的同分異構(gòu)體。當(dāng)5'-CCGG-3'四核苷酸中的內(nèi)部CpG甲基化時(shí)，EpiHpall的切割被阻斷，但EpiMspl的切割不受影響。

四、甲基化檢測(cè)的幾種方法的實(shí)驗(yàn)流程

1、BSP/MSP的實(shí)驗(yàn)流程

2、酶切法實(shí)驗(yàn)流程

五、甲基化檢測(cè)的幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)

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