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一、實時熒光定量PCR的概念

什么是QPCR？實時熒光定量PCR檢測技術是指在PCR反應體系中加入可與DNA產(chǎn)物異形結(jié)合的熒光基團，利用熒光信號積累監(jiān)測整個PCR過程，最終通過相對定量和絕對定量的方法確定各個樣本的表達量。

二、QPCR實驗的應用及分類

關于QPCR絕對定量和相對定量的應用，絕對定量技術通常在病原體檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及基因表達研究中應用比較廣泛；相對定量應用于mRNA表達量分析、siRNA干擾效果的驗證和基因過表達以及基因芯片效果的驗證。

三、QPCR技術的兩大分類優(yōu)缺點對比

四、實時熒光定量PCR的實驗步驟：

1、樣本制備；

2、RNA提取；

3、反轉(zhuǎn)錄；

4、QPCR引物設計及預實驗；

5、實時熒光定量QPCR數(shù)據(jù)分析。

定量.png

五、QPCR實驗技術有哪些注意事項

1、擴增曲線和熔解曲線

對于QPCR實驗中涉及到的擴增曲線和熔解曲線需要做如下的要求，由于擴增曲線是反映PCR循環(huán)數(shù)與熒光強度的一條曲線，所以這條曲線要平滑完整，而熔解曲線是將溫度與熒光強度的變化求導得到是對數(shù)圖譜，所以要求熔解曲線是單一峰；

2、Ct值

同樣是QPCR實驗中需要注意的重要參數(shù)，它是PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)，也就是說，我們達到一個平臺期的時候，Ct值的起始value與平臺期之間存在一個Ct循環(huán)數(shù)的差異，我們稱之為該基因的擴增倍數(shù)。經(jīng)過了多少個循環(huán)數(shù)達到平臺期所求出來的差值就是我們的Ct值。其特點是DNA模板量越多，達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)越少，所以Ct值越小。

如圖所示，它的Ct value越偏向于右邊，它的起始模板量越少，越偏向于左邊，起始模板量越高。而它們最終都是要達到一個平臺期的。

3、反應體系配置

配置體系時需要注意以下幾點：

①SYBR MasterMix不要反復凍融；

②在一個管中配置Mix，減少加樣誤差；

③所有成分加完后，離心去除氣泡；

④每個樣品至少3-4個平行孔，方便進行統(tǒng)計學分析；

⑤需設置NTC陰性對照組，驗證實驗材料是否具有污染。

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