ChIP 實驗中染色質(zhì)免疫共沉淀的關鍵要點，新手少走彎路
2025-07-18 17:51:48
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
ChIP 實驗中染色質(zhì)免疫共沉淀的關鍵要點由普拉特澤生物分子實驗平臺為大家總結(jié)分享。普拉特澤生物為廣大科研人員提供長期穩(wěn)定的ChIP實驗服務，本文給大家分享咱們技術長期總結(jié)下來的ChIP實驗的8個關鍵控制點，幫助新手少走彎路，獲得可重復的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。
甲醛濃度：1%甲醛（哺乳動物細胞）vs 1.5%（植物/真菌）
交聯(lián)時間：10-15分鐘（過長會導致抗原表位遮蔽）
關鍵技巧：加入終濃度125mM甘氨酸淬滅反應
超聲破碎：
目標片段大?。?00-500bp（轉(zhuǎn)錄因子ChIP）或500-1000bp（組蛋白修飾）
必須驗證：通過2%瓊脂糖凝膠確認片段分布
酶解法替代方案：Micrococcal Nuclease（MNase）更適合核小體定位研究
必做對照：
Western Blot驗證特異性
敲除/敲低細胞陰性對照
使用商業(yè)已驗證抗體（推薦Abcam#ab1791等ChIP級抗體）
(2) 濃度優(yōu)化矩陣實驗
建議梯度測試：
3. 免疫沉淀：容易被忽視的細節(jié)
(1) 磁珠預處理
? Dynabeads蛋白G使用流程：
1. PBS洗滌3次
2. 用0.5%BSA封閉30分鐘
3. 抗體結(jié)合時保持4℃旋轉(zhuǎn)孵育（6小時最佳）
(2) 洗滌緩沖液配方升級
? 低嚴格度洗滌：RIPA緩沖液（150mM NaCl）
? 高嚴格度洗滌：RIPA+500mM NaCl（降低非特異結(jié)合）
? 去污劑選擇：用0.1% Sarkosyl替代Triton X-100可減少背景
4. DNA回收：數(shù)據(jù)丟失的重災區(qū)
(1) 解交聯(lián)方案對比
(2) 柱回收vs酚氯仿
? 硅膠柱回收：保留>100bp片段（推薦Qiagen MinElute）
? 酚氯仿抽提：需額外進行糖原共沉淀（回收率提高20%）
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5. 質(zhì)量控制：多數(shù)實驗室缺失的步驟
(1) 實時監(jiān)測指標
? 片段大小：Bioanalyzer檢測（比凝膠更精確）
? DNA得率：Qubit dsDNA HS檢測（靈敏度比Nanodrop高100倍）
? 富集效率：陽性對照位點ΔCt應≤5（vs input）
(2) 必做功能對照
? 陽性對照：GAPDH啟動子（組蛋白修飾）或已知結(jié)合位點
? 陰性對照：基因沙漠區(qū)域或使用IgG
6. 數(shù)據(jù)分析：從原始數(shù)據(jù)到發(fā)表級結(jié)果
(1) 定量方法選擇樹
(2) 必須報告的參數(shù)
? PCR效率：標準曲線斜率應在-3.1~-3.6之間
? 置信區(qū)間：至少3次獨立生物學重復
? 統(tǒng)計方法：Mann-Whitney U檢驗（非正態(tài)數(shù)據(jù)）
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7. 高階技巧：頂級實驗室的秘籍
(1) 交叉linking方案
? 雙交聯(lián)：先用2mM DSG處理45分鐘，再用1%甲醛（適用于難結(jié)合蛋白）
(2) 微量ChIP優(yōu)化
? 1000個細胞也能做：使用MAGnify? ChIP Kit（Thermo Fisher）
(3) 自動化解決方案
? 推薦平臺：IP-Star?自動化系統(tǒng)（減少人為誤差）
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8. 常見問題速查表
掌握這些核心要點，你的ChIP實驗成功率將提升300%。建議收藏本指南作為實驗室標準操作手冊，并分享給經(jīng)常抱怨"ChIP做不出來"的同事。記?。撼晒Φ腃hIP=50%實驗設計+30%細節(jié)控制+20%數(shù)據(jù)分析！
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