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CHIP檢測(cè)

核酸和蛋白質(zhì)是組成生命的主要生物大分子,兩者的相互作用是構(gòu)成生命活動(dòng)的生長(zhǎng)、繁殖、運(yùn)動(dòng)、遺傳和代謝等生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。研究蛋白質(zhì)和核酸間的相互作用是人們探索生命現(xiàn)象奧秘的關(guān)鍵,CHIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用于蛋白與核酸互作關(guān)系的重要參考。

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實(shí)驗(yàn)介紹

【應(yīng)用簡(jiǎn)介】

核酸和蛋白質(zhì)是組成生命的主要生物大分子,兩者的相互作用是構(gòu)成生命活動(dòng)的生長(zhǎng)、繁殖、運(yùn)動(dòng)、遺傳和代謝等生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。研究蛋白質(zhì)和核酸間的相互作用是人們探索生命現(xiàn)象奧秘的關(guān)鍵,ChIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用于蛋白與核酸互作關(guān)系的重要參考。


【實(shí)驗(yàn)原理】

CHIP實(shí)驗(yàn)在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè),從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。


【實(shí)驗(yàn)方法】

Step1:細(xì)胞培養(yǎng)物交聯(lián)和樣品制備

Step2: 胞核制備和染色質(zhì)消化

Step3:染色質(zhì)消化和濃度分析

Step4:染色質(zhì)免疫沉淀法

Step5:將染色質(zhì)從抗體/Protein G Magnetic Beads上洗脫下來并解交聯(lián)

Step6:使用離心柱純化 DNA

Step7:用 PCR定量 DNA



CHIP檢測(cè).png


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案例展示

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【結(jié)果分析】

1、陽性對(duì)照組條帶清晰無雜帶,陰性對(duì)照組正常,表明CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信,操作合格;

2、Input組條帶清晰可見,表明PCR擴(kuò)增引物可用于該指標(biāo)的檢測(cè)

3、樣本組1和樣本組2中檢測(cè)XX蛋白組均有條帶,表明該研究的基因的啟動(dòng)子區(qū)和XX蛋白可發(fā)生結(jié)合。


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【結(jié)果分析】

1、陽性對(duì)照組條帶清晰無雜帶,陰性對(duì)照組正常,表明CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信,操作合格;

2、Input組條帶清晰可見,表明PCR擴(kuò)增引物可用于該指標(biāo)的檢測(cè);

3、樣本組中檢測(cè)XX蛋白組無條帶,表明該研究的基因的啟動(dòng)子區(qū)不可以和XX蛋白發(fā)生結(jié)合。

技術(shù)總結(jié)

【常見問題】

1、消化的染色質(zhì)濃度過低。

2、染色質(zhì)消化不足且片段過大(大于900 bp)。

3、樣品輸入對(duì)照組PCR反應(yīng)中無產(chǎn)物或產(chǎn)物很少。

4、陽性對(duì)照組蛋白H3-IP RPL30 PCR反應(yīng)中無產(chǎn)物。

5、陰性對(duì)照 Rabbit IgG-IP 和陽性對(duì)照 Histone H3-IP PCR 反應(yīng)中產(chǎn)物的數(shù)量相等。

 

【注意事項(xiàng)】

1、ChIP實(shí)驗(yàn)要求必須是新鮮的組織或活細(xì)胞,一次實(shí)驗(yàn)需至少需要150 mg新鮮的組織或2x10?個(gè)細(xì)胞,如不能提供新鮮的組織或活細(xì)胞,請(qǐng)聯(lián)系客服,獲得預(yù)處理方法;

2、部分抗體級(jí)別可能達(dá)不到ChIP級(jí)別的要求,需要采購對(duì)應(yīng)級(jí)別的抗體并通過陰陽性實(shí)驗(yàn)反饋結(jié)果可信性;

3、ChIP對(duì)照:現(xiàn)有陽性對(duì)照H3和陰性對(duì)照IgG;

4、采用CST品牌的SimpleChIP? Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads)試劑盒用于本實(shí)驗(yàn)。

送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)

樣品類型樣品需求保存條件運(yùn)輸條件備注
動(dòng)物組織單個(gè)樣品>0.1g,2mlEP管或凍存管裝,不要過量;樣本應(yīng)盡量新鮮,如不能立即提取蛋白或核酸,應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低,凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解-80℃干冰所有樣本均須有唯一標(biāo)記,且標(biāo)記清晰可識(shí)
種子樣本去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本,單個(gè)樣品>0.2g。-80℃干冰
貼壁/懸浮細(xì)胞

1. 總RNA或蛋白:106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白:107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白:2*107     cell/指標(biāo),樣本盡量新鮮,細(xì)胞收取后直接加Trizol(QPCR檢測(cè))或直接凍存于-80℃       

2. 若細(xì)胞處理(加藥、轉(zhuǎn)染、感染)后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量

-80℃干冰
全血/血清樣品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蠟包埋樣品由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊,有效厚度大于 0.1cm; 新鮮的 FFPE 組織切片,每片厚度不超過 10μm,2~8 張,表面積不超過 250mm2。-20℃冰袋
抗體

1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體;

2. 按抗體說明書要求寄送,盡量避免分裝;如分裝,確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并提供抗體說明書。

3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記,抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物, 附帶公司引物合成單。-20℃冰袋或常溫




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