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        熒光定量PCR實驗操作步驟由普拉特澤生物跟大家一起學習進步，熒光定量PCR技術作為表達檢測平臺重要的實驗手段，以成熟的技術手段專業(yè)承接熒光定量PCR代做服務，同時更積累了大量的實操經(jīng)驗，今天咱們就來跟大家一起一步一步來看，熒光定量PCR的操作步驟是怎樣的！

        熒光定量PCR的操作步驟可以簡單概括為：RNA 提取 → 反轉(zhuǎn)錄 → 設計引物 → Q-PCR，咱們一步一步看。

        熒光定量PCR第一步：RNA提取

        1、首先進行不同樣本的預處理：

        （1）組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。

        （2）全血樣品：加入3-5倍體積的紅細胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。

        （3）細胞樣品：懸浮液中生長的細胞，通過離心收集細胞后，每1×105?106細胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細胞，可以移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細胞。

        2、直接法提取RNA

        （1）加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。

        （2）4℃，12000rpm離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中。

        （3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。

        （4）4℃，12000rpm離心15min。混合液分三層，包括最下面的苯酚 - 氯仿有機相，中間相和上層水相。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。?/span>Note：質(zhì)量比數(shù)量更重要！）

        （5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。

        （6）4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。

        （7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風干5-10min（不要太干，過度干燥會導致RNA難溶解?。?。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。

        （8）立即進行反轉(zhuǎn)錄反應，或先-80℃長期保存。

        熒光定量PCR第二步：反轉(zhuǎn)錄

        1、RNA純度和完整度鑒定

        紫外分光光度法測定RNA濃度和純度：在pH8.0的TE緩沖液中稀釋RNA，并在260nm和280nm下測量吸光度，一般Abs 260nm：280nm比率應該是1.7-2.1，說明RNA的純度較好。

        RNA條帶完整度測定：評估RNA的完整性，取部分樣本做瓊脂糖凝膠電泳。完整的RNA條帶包括28S，18S和5S核糖體RNA。通常，28S / 18S> 2意味著RNA具有較高的完整度。

        2、反轉(zhuǎn)錄：PCR條件：42℃孵育40min，85℃加熱5min，4℃保存。將第一鏈cDNA儲存在-20℃。

        熒光定量PCR第三步：引物設計

        引物設計標準

        （1）PCR擴增子長度：50-180bp；

        （2）引物長度17-25bp；

        （3）GC含量：45-55％；

        （4）Tm：58?68℃，引物對間差異不大于2℃；

        （5）堿基要隨機分布，盡量均勻。3′端要避開AT，GC rich的區(qū)域，避開T/C或A/G連續(xù)結構（2-3個）。引物自身和引物間不能存在互補。引物3’末端為G或C；

        （6）避免DNA污染，跨外顯子接頭區(qū)；

        （7）至少設計2-3對引物，預實驗篩選最佳引物；

        （8）將所有設計的引物在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對以確定它們對靶基因特異性。

        熒光定量PCR第四步：Q-PCR反應

        注意： 一般使用cDNA模板的10倍稀釋液加入反應體系，因為過高濃度的反轉(zhuǎn)錄體系殘留如逆轉(zhuǎn)錄酶和相關緩沖液組分會抑制DNA聚合酶活性，從而降低擴增效率。

        1、擴增循環(huán)。

        2、溶解程序：擴增循環(huán)結束后，降溫至60℃，然后加熱升溫至95℃變性DNA產(chǎn)物。

        變性：高溫孵育將dsDNA變成成單鏈，并松弛ssDNA中的二級結構。 通常DNA聚合酶可承受的最高溫度為95℃。如果模板GC含量高，可適當延長變性時間。

        退火：退火期間，互補序列結合，一般使用低于引物的Tm 5℃作最適退火溫度。

        延伸：70-72℃，DNA聚合酶活性最佳，并且以每秒100個堿基的速率延伸。當qPCR中的產(chǎn)物長度較小時，此步驟可與退火在60℃同步進行。

        最后進行熒光定量PCR實驗的數(shù)據(jù)分析，那實驗步驟我們就講解到這里啦，下期咱們講講，最后一步的數(shù)據(jù)分析應該如何分析，如何看熒光定量PCR的結果，如多您也想學習更多關于熒光定量PCR的實驗和結果分析或有熒光定量PCR代做外包的需求歡迎給普拉特澤留言，技術會第一時間聯(lián)系到您的哦~