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流式檢測——細胞周期檢測常見問題解答與處理【干貨滿滿】

流式檢測細胞周期實驗的常見問題解答由普拉特澤生物根據(jù)承接的幾千例流式檢測細胞周期實驗和各種實驗過程中的技術(shù)咨詢總結(jié)而來，普拉特澤生物專注提供線下生物實驗研究，積累了大量經(jīng)驗，為廣大科研工作者提流式檢測細胞周期等各類生物學(xué)實驗外包。

前兩篇呢，我們講了用流式檢測細胞周期的實驗原理、步驟以及操作時的注意事項，鏈接奉上，忘記的同學(xué)請自行回去復(fù)習(xí)：

流式檢測細胞周期實驗注意事項

流式檢測細胞周期原理及實驗步驟分析

這兩篇常見問題集大家咨詢的流式和細胞周期檢測問題、我們自己操作時總是遇到的問題之大成，拿好筆記本我們準(zhǔn)備開始記錄吧：

問題一：在測定細胞周期的時候,由于固定、消化等處理后會出現(xiàn)很多細胞碎片，影響測量結(jié)果，無法找到G1期細胞群怎么辦？

回答：在測定細胞周期的時候，除了設(shè)置好獲取數(shù)據(jù)的模版外，另外設(shè)置直方圖，測量模式為對數(shù)(log)，調(diào)整放大倍數(shù)，使二倍體峰出現(xiàn)在橫坐標(biāo)10*3的位置，就很容易的找到了二倍體峰和細胞周期個時相細胞的分布情況。

問題二：可不可以用70~75%乙醇直接固定細胞，反正乙醇固定細胞的終濃度也是這么多？

回答：當(dāng)然不可以，直接用70~75%乙醇加入很容易導(dǎo)致細胞聚團現(xiàn)象，很難重懸成單細胞，影響固定效果，甚至容易導(dǎo)致固定后無細胞沉淀的現(xiàn)象。應(yīng)該在細胞充分分散成單細胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為70~75%乙醇。

流式檢測細胞周期常見問題解答與處理

問題三：細胞量太少，得不到數(shù)據(jù)結(jié)果白做了咋辦？

回答：咱就是說，待測的細胞已經(jīng)制備完了太少不容易挽救，說一說正確的操作方法吧。

1）首先，要保證收集足夠的細胞樣品，普拉特澤技術(shù)小姐姐推薦至少需要手機10的6次方左右；如果藥物處理后細胞死亡過多，應(yīng)該降低藥物濃度。

2）然后，固定細胞時先用預(yù)冷的PBS重懸細胞，再逐滴滴入無水乙醇中，操作方法請參照上一步。

3）同時細胞清洗時，不可過度吹打細胞，以防產(chǎn)生過多的細胞碎片。

4）最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點，不要吸完。

問題四：做流式分析細胞周期時，收集了10^6左右的細胞，但是固定后沒有細胞沉淀，甚至PBS洗滌后上機已經(jīng)沒有細胞了，哪個環(huán)節(jié)出了問題？

回答：確定收集了足量細胞但是沒有細胞沉淀且上機沒看見待測細胞的話，應(yīng)該洗滌過程中細胞丟失了。應(yīng)該：

1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機。

2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒，吸上清時最好殘留1 mm左右的水膜，不要吸完。

3）離心的轉(zhuǎn)速或時間可以適當(dāng)增加。

4）每次加試劑時，吸頭最好不要接觸液面，混勻時最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細胞。

問題五：什么樣的結(jié)果是正常的？

回答：請大家抱著結(jié)果自己對號入座~

1）G2/M期細胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方圖上形成一個2倍于G1信號峰的高斯峰。

2）CV(變異系數(shù))表示峰的寬度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被認(rèn)可。

3）RCS最好是在1~3，高于5則不被認(rèn)可。RCS高，說明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細胞的時候RNA酶消化不好，或者是PI的濃度不佳造成的。

問題六：怎樣提高實驗結(jié)果的分辨率和精確度？

回答：變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV值）反映G0/G1峰分辨率和精確度。而樣品CV值為樣品固有，與樣本制備過程中細胞質(zhì)量有關(guān)。細胞碎片越少、細胞聚團越少、RNA酶消化越充分，可以減少樣本的CV值，提高G0/G1峰分辨率和精確度。
好啦，流式檢測細胞周期操作過程中我們比較常見的問題就給大家回答到這里,歡迎大家踴躍留言，湊齊八個我們召喚神龍！
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